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【本文為樂(lè)楓RephiLe公司原創(chuàng)文章,轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明,違者必究。】
摘要：上海樂(lè)楓市場(chǎng)部在本文中為用戶提供了SDS-PAGE銀染實(shí)驗(yàn)的基本步驟以及相關(guān)純水應(yīng)用方案。通過(guò)闡述水中雜質(zhì)對(duì)銀染實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的影響，詳細(xì)解釋了為什么銀染實(shí)驗(yàn)應(yīng)該中應(yīng)該使用EDI純水。
SDS聚丙烯酰胺凝膠染色是蛋白質(zhì)研究的一個(gè)基礎(chǔ)方法。染色方法有很多，實(shí)際應(yīng)用中，考馬斯亮藍(lán)染色（考染）和銀染是運(yùn)用的多的方法。
考馬斯亮藍(lán)G250在游離狀態(tài)下呈紅色，它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，結(jié)合物在595 nm波長(zhǎng)下有大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。
銀染實(shí)驗(yàn)中，在堿性條件下，銀離子被還原成金屬銀，沉淀在蛋白質(zhì)的表面上顯色。蛋白電泳后的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠在甲醇溶液中浸泡后，水洗后用硝酸銀溶液銀染，再水洗后用碳酸鈉甲醇水溶液顯色。
與考染相比，銀染具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，很多做環(huán)境、植物、育種等方面的客戶，都會(huì)做銀染方面的實(shí)驗(yàn)。銀染對(duì)于試劑的要求比較高，尤其對(duì)其中使用純水的水質(zhì)要求比較高。上海樂(lè)楓（RephiLe）技術(shù)人員根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)以及相關(guān)文獻(xiàn)中的方法為用戶提出以下銀染實(shí)驗(yàn)方案：
一、儀器和試劑
乙酸（1%），顯影液（2.5%碳酸鈉和0.02%甲醛水溶液），乙醇（30%），固定液（乙醇:冰醋酸:水（30:10:60）），硝酸銀溶液（0.1%），顯影液（將溶液A在850 mL去離子水中加入37 g NaCl和37 g CuSO4，再加入濃氨水直到深藍(lán)色沉淀形成然后溶解，定容至1 L）和溶液B（在900 mL去離子水中加入436 g 硫代硫酸鈉，定容至1 L）混合，加三倍水稀釋，立即使用
二、試驗(yàn)方法
1. 通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)；
2. 將凝膠浸泡在至少5倍體積的固定液中，室溫下平緩搖動(dòng)4 - 12 h，使蛋白固定；
3. 棄去固定液，加至少5倍體積的30%乙醇，室溫下平緩搖動(dòng)30 min；
4. 重復(fù)步驟3；
5. 棄去乙醇，加10倍體積的純水（去離子水），室溫下平緩搖動(dòng)10 min；
6. 重復(fù)步驟5兩次；
7. 棄去清洗用水，加5倍體積的硝酸銀溶液，室溫下平緩搖動(dòng)30 min；
8. 棄去硝酸銀溶液，用純水（去離子水）漂洗凝膠兩面，每面20 s；
9. 加5倍體積的新鮮顯影液，室溫下平緩搖動(dòng)，數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)蛋白質(zhì)的染色條帶，繼續(xù)至條帶清晰；
10. 用1%乙酸清洗凝膠終止反應(yīng)，再用純水（去離子水）水漂洗數(shù)次，每次10 min。
銀染后的凝膠可以通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)或掃描儀轉(zhuǎn)化為照片，或者可以直接用手機(jī)拍攝。
在銀染實(shí)驗(yàn)中，純水（去離子水）水質(zhì)非常重要，對(duì)實(shí)驗(yàn)成功與否起著關(guān)鍵性的作用。有用戶在實(shí)驗(yàn)中忽略了這一點(diǎn)，純水水質(zhì)不佳，導(dǎo)致氯離子含量超標(biāo)，浸泡時(shí)出現(xiàn)硝酸銀沉淀，沉淀在膠上，后顯影的時(shí)候看到的是一片花花的亂象，影響了染色效果。
氯化銀的溶解度通常是2 ppm，氯離子是水中常見(jiàn)的一種離子雜質(zhì)，如果水中的氯離子超過(guò)2 ppm，即有可能出現(xiàn)雜質(zhì)，也就是說(shuō)，對(duì)于銀染實(shí)驗(yàn)，對(duì)于純水質(zhì)量的要求還是比較苛刻的，一般的反滲透純水（RO）設(shè)備，還難以達(dá)到要求。
另外，水中的顆粒物也會(huì)吸附銀離子沉淀顯色，污染背景，甚至讓好好的凝膠成了“大花臉”。因此制備出來(lái)的純水在使用前，還應(yīng)該通過(guò)0.22或0.45μm的過(guò)濾器預(yù)先過(guò)濾，以去除水中的顆粒物。
專業(yè)來(lái)講，銀染用水應(yīng)該盡量選用符合國(guó)標(biāo)《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》（GB/T 6682-2008）二級(jí)純水以上的水——電導(dǎo)率至少應(yīng)當(dāng)在 1 μS/cm以下。
因此，銀染用水應(yīng)當(dāng)使用EDI純水或者超純水，而RO 純水是不能滿足銀染用水需求。
國(guó)內(nèi)做實(shí)驗(yàn)室EDI純水設(shè)備的廠家很少。樂(lè)楓是國(guó)內(nèi)早生產(chǎn)EDI實(shí)驗(yàn)室純水設(shè)備的供應(yīng)商。樂(lè)楓新一代 Genie G 智能型一體化超純水系統(tǒng)可以同時(shí)制備EDI 純水和超純水。Genie G 生產(chǎn)的 EDI 純水水質(zhì)*銀染實(shí)驗(yàn)，還可以用來(lái)配制其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)的試劑；超純水可以應(yīng)用于銀染實(shí)驗(yàn)的上下游以及其他蛋白質(zhì)研究實(shí)驗(yàn)，例如蛋白SDS-PAGE電泳、Western Blotting等。取水終端安裝的RephiBio濾器，可以制備無(wú)熱原（內(nèi)毒素）、核酸酶、細(xì)菌的超純水，用于生化分析和分子生物學(xué)。Genie G一機(jī)兩水，高度集成，可以充分滿足生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室整體用水的需求，質(zhì)量不輸進(jìn)口設(shè)備，用戶使用起來(lái)，*可以“用水無(wú)憂”。
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